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实现超滤富集!色谱层析方法达到最好的分离能力

实验室资讯网时间:2018-08-15 点击: 百度搜索

【导读】50-100KDa的膜截留的超滤技术是早期IgG的纯化技术中的难点之一。硫酸聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示,大部分宿主细胞蛋白的分子量要小于该滤膜孔径,因此,IgG能被有效截留。 同时浓缩和更改缓冲液有利于后续优化步骤。正是这一特点使该技术成为捕获LgG蛋白最合适的候选方法,然而事实上作用效果并没......
TAG标签: 超滤富集 色谱层析方法 分离能力

50-100KDa的膜截留的超滤技术是早期IgG的纯化技术中的难点之一。硫酸聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示,大部分宿主细胞蛋白的分子量要小于该滤膜孔径,因此,IgG能被有效截留。

同时浓缩和更改缓冲液有利于后续优化步骤。正是这一特点使该技术成为捕获LgG蛋白最合适的候选方法,然而事实上作用效果并没有达到预期的效果。

膜污染后会妨碍后续通过膜过滤而富集蛋白的效果,同时宿主细胞污染物在LgG中的含量会增多。Protein A蛋白亲和层系色谱法是目前富集免疫蛋白较好的方法。超滤一般作为蛋白初步纯化后的,辅助后续蛋白浓缩和膜渗滤的技术。

目前已知,蛋白A功能有高重复性并具有很高的结合力,但如超滤一样,要应用于IgG的纯化,他必须具有比以往更强的结合传输能力才行。在应用于色谱前,蛋白A因其与IgG精准的特异性结合力而备受青睐。大家抱着一种期望,即使用亲和层系色谱技术,将蛋白纯化一步到位。但是在实际实践中发现,纯化后的蛋白中通常能检测到浓度为1000-10000ppm的宿主细胞蛋白污染物,且会有DNA残留。这一结果看上去不太合理,因为蛋白A 可能会与其他物质亲和,但实际上并非如此。这些物质的残留表明,这些污染物替代了IgG,反而与蛋白A结合。目前已知道蛋白A结合技术令人失望主要来源于样品处理过程中的色谱介质的化学污染。化学污染不同于物理污染,物理污染主要包括一些细胞或者尺寸足够大的碎片会堵塞滤膜或色谱柱,而化学污染主要指一些污染物与纯化介质表面的非特异性化学作用。在细胞培养后的收获液中,20-40%的宿主污染物结合在由上百种物质组装成的复杂化合物中。有的结合力比较弱,有些结合力很强,其中某些组分与蛋白A的结合能力比LgG与蛋白A的结合力还要强并能作为一些与色谱介质亲和力弱的物质的锚定位点。

实现超滤富集!色谱层析方法达到最好的分离能力

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色谱表面这些组装物的堆积会干扰色谱纯化作用,主要有以下两种途径:其一:50–400 nm 的聚体会堵塞IgG通向色谱柱微粒中的弥散孔道;这与装载纯化后的IgG比,动态负载容量下降量高达20%。随后IgG的洗脱条件也会使锚定的污染物组分洗脱下来,而这部分洗脱下来的污染物仍会留在IgG组分中。从蛋白A 中洗脱下来的IgG中含有的宿主污染物有99%来源于这一步。

化学污染效应不止局限与蛋白A,它会削弱所有的色谱方法,它会使传统型或多模式型阳离子交换色谱的能力下降50-65%。化学污染甚至会使分子排阻色谱法也举步维艰,在该纯化方法中色谱微粒的化学表面会被钝化。事实上许多异源结合物与分子排阻色谱有很强的相互作用以至于会造成洗脱图谱的拖尾而不能严格按照聚体分子量的大小实现组分分离。

在柱子装载前消除这些化学污垢会显著提升柱效:用蛋白A去除宿主细胞蛋白和DNA能够分别提高100和1000倍的柱效。IgG的结合能力能提高至纯化的IgG结合水平。而离子交换色谱和多通道采集甚至能得到更好的效果。

借于化学污染能削弱所有色谱分析效果因此提前去除化学污染能够使色谱分析法达到其最好的分离能力,实现超滤富集,已达到十九世纪八十年代的设想。

  本文对这些问题进行了详细的阐述,并做了进一步的探究

从细胞培养收集液中去除的主要化学污染物包括:带强负电荷和正电荷的组分,强疏水性组分,溶解度最大和最小的组分。该方法主要是通过向游离细胞或细胞内含物收集液中添加絮凝剂实现的。尿囊素晶体会通过氢键结合聚体,病毒和内毒素;辛酸会聚沉多种宿主细胞蛋白和病毒。带正点的聚体,微粒,或深层过滤则主要针对DNA,病毒和一些酸性宿主细胞蛋白。去除这些固体颗粒便可以排除40-70%的宿主细胞蛋白,99%的DNA,2-3logs的内毒素,5-9logs病毒和75-95%的聚体。而典型的IgG抗体最多会损失10%,且主要为一些与聚体结合的错误折叠的蛋白。其他的方法在文献中也有探讨。

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图3 显示了中国仓鼠卵巢细胞培养收集液絮凝前后的SEC图谱。那些分子量逐步增长逼近IgG峰的聚体中,包含了错误折叠的IgG, 但含量更多的是与染色质成核中心相结合的宿主细胞蛋白。这也说明了为什么不能用超滤法收集LgG。这些具体本应该与IgG一起滞留与它们与孔道相作用的部位,并且处理后与IgG一样同为滞留物。图3中右手边的图显示了为什么提前进行絮凝处理能使超滤达到显著的效果。

  为捕获完整LgG蛋白的超滤吸附技术

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图4展示了一套基础的超滤-吸附一体化(流水线)设备。第一个图框内只显示了线性处理过程中的超滤系统。图框2显示了一体化处理中伴有吸附性色谱的流动路线。除了添加了吸附通道,还添加了一些作用于洗脱或流动相中的特定的吸附剂。图5 展示了一款拥有两个吸附通道的早期处理模型。

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  平衡

处理前要先平衡系统。平衡缓冲液与吸附色谱药品装载条件相同。在这个过程中吸附剂不在工作状态,但超滤系统一直在线处理。在样品载入后浓缩和膜渗透同时进行,在这个过程中大部分小分子污染物通过渗透作用被清除。在滞留物被完全平衡前吸附剂开始发挥作用,与吸附剂作用的滞留物随缓冲液的改变和浓缩过程也一直在系统中循环。当缓冲液条件与平衡条件达到一致时,该处理过程结束。

  整体柱和吸附膜

吸附色谱可以分为整体柱、吸附膜或特定的色谱柱。整体柱和膜与选择性类似物吸附柱相比,每单位体积与蛋白结合能力较低。但超滤这一步骤减小了对容量的需求,同时整体柱和膜在较高的流速下比柱子有更好的结合效率。因为在集成处理中,需要有较大过滤面积和较快流速以得到较为合理的处理时间,因此,在集成化处理中整体柱和膜更有使用价值。

整体柱和膜有更好的使用介质也是被优先选择的一个原因。因为两者都是对流传质,因此只需一步传递过程便可实现饱和。对流传质效率不受流速和溶质的大小的影响。有多空微粒的特定色谱柱主要靠样品在孔道中的弥散,而弥散效率也主要取决于流速和溶质的大小。这很好的解释了为什么单步传质载入不能是色谱柱饱和,而必须采用多步载入。

实现超滤富集!色谱层析方法达到最好的分离能力

暂不考虑其低效,色谱柱在蛋白的纯化中仍不失为一个重要的方法。因为它比整体柱和膜有更多的配基可供选择,尤其是包含多种类型的吸附剂。而其线性流速这一短板也因为轴向和流向的较短的柱床得以弥补。多孔道微粒色谱柱的另一个优势即它可以根据分离物所需的容量需求定制与之相匹配的柱子。

实现超滤富集!色谱层析方法达到最好的分离能力

图7显示的为赫赛汀类似物的实验结果。其中化学污染物已如前文所述,经过尿囊素、辛酸、带正点的微粒和深层过滤等方法提前清除。所用缓冲液为pH8.0,浓度为50mM的Tris。抗体经过实验处理浓度能达到20g/L。当浓度达到2.5DV后加入吸附剂,达到5DV时处理过程结束。处理过程为4-7小时,处理后宿主细胞蛋白含量低于37ppm,DNA含量低于1ppd,聚体含量约为0.1%,回收率为86%。

表一结果显示了同一细胞系用不同污染物去除方法,不同的超滤介质和不同的吸附剂处理后的的收获液的实验结果。简言之,30KDa的纤维素膜和50KDa的PES膜的处理效果基本相同。100kDa级的膜对这种抗体会造成一定的损失,但可能会适用于其他类的抗体。整体柱,吸附膜和多孔道微粒色谱柱可互相代替。强离子交换吸附剂和弱离子吸附可互为替换。多模式阳离子交换吸附剂与苯基膜可互为替代。

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当然这并不是说该技术适用于所有吸附剂和抗体。应用于其他抗体时,用不同的吸附剂处理效果也会有不同。但是在左右情况中,污染物的去除效率对处理效果的影响最为显著。若不进行污染物的处理会导致最常见的失败,即宿主细胞蛋白浓度会达到10000-30000ppm。

  蛋白单独捕获后的超滤吸附处理

实现超滤富集!色谱层析方法达到最好的分离能力

图8 简要概括了蛋白A在洗脱液pH3.5时进样的一种纯化方法。在弱阴离子交换整体柱中进行循环富集时,在缓冲液浓度达到50mM EMS,pH为5.5时,富集浓度能达到25g/L。一种0.22-µm 过滤膜置于整体柱前,以除去pH调整过程中一些物质引起的浊度变化。事实上,有一种抗体是一个罕见的例外,尽管提前处理去除了污染物,但经过蛋白A处理这一步骤后,纯化的此蛋白中仍会含有>2000ppm的宿主细胞蛋白。但协同超滤-吸附方法,仍能将宿主细胞蛋白、DNA 和聚体分别降到10ppm、1ppd和0.1%以下。

该方法能将宿主细胞蛋白从2000将到10ppm最大的两个亮点在于:其一,通过暂停装置使纯化过程暂缓,先去除污染物进而使纯化效果能达到其本来应有的效率;其二,保证整个流动处理过程中超滤通道一直发挥作用,以去除整个循环过程中一些小分子污染物。因为能去除系统中的非吸附性污染物,因此该方法对流动处理结果的优化有极其重要的作用。相比之下,非吸附性污染物在传统的流穿色谱中仍会残留在抗体中。

  协同多步色谱层析处理

协同单一吸附通道的流穿法是最令人感兴趣的:这种方法只消耗更少的流动相和更少的处理时间,但可以在单一设备上添加额外的吸附通道来完成多步纯化。

对于有两个流穿通道的设备来讲,处理过程与平衡和浓缩同时进行。第一个吸附通道开启并一直保持到样品平衡结束。之后关闭第一个吸附通道,启用第二个吸附通道。第二个系统用去除污染物效果最佳的缓冲液平衡。然后用洁净的缓冲液冲洗系统以置换流路中的产品,最后用0.1M的NAOH对系统进行消毒。

在结合-洗脱过程中使用吸附剂会消耗跟多的缓冲液和更多的时间但同时也能得到浓度更高的产品。并且该方法跳过了处理过程中流动相更换的难题。一旦你所需的蛋白进入系统中,便与吸附过程同步更换缓冲液。大分子量的非IgG蛋白,例如IgM和VIII 因子,尤其是血管假性血友病因子表明他们是天然的超滤透析分子,因为它们可以自发调整膜以适应更大孔道的分布,对更多污染物有消除潜力。

实现超滤富集!色谱层析方法达到最好的分离能力

实现超滤富集!色谱层析方法达到最好的分离能力

病毒颗粒也是疫苗,基因靶向治疗和抗生素的重要代替物。图9简要说明了两通道设备对噬菌体的纯化。处理过程主要包括浓缩和与平衡至50mM,pH6.0的平衡过程同步进行的去污过程,之后产品再结合到阳离子交换整体柱上。阳离子交换完成后关闭程序,再开启阴离子交换整体柱。流动相调整至50mM HEPES,pH7.0,在此条件下病毒结合,之后在进行洗脱。

  未来的方向

生物制药行业的不断发展对协同超滤-吸附技术能否实验蛋白纯化这一理想提出了明显的质疑。答案是肯定的,但是要用一种完全不同于以往的技术,例如SMB色谱技术,该项技术是真正意义上的连续处理:它以产品成产的速率来不断处理产品,并连续不断的传输处理后的产品。但是该技术在一台设备上只提供一种色谱方法,多种设备只能用多部处理才能进行。每台设备包括数十种移动部分,每天协调上千种处理项目。方法开发需要极其复杂的模拟软件在多种柱子上模拟非直观的逆向色谱活动。

超滤-吸附一般用于批处理,但是也可支持在单一设备上完成纯化的全过程。在单步处理时,可在处理前和处理后对系统的所有部件进行消毒。一个简单的缓冲缸来收集循环中获得的收集液便可实现全天连续性生产。甚至每个系统都为多个吸附步骤进行了配置,包括只有一个部分的活动部件和SMB所需的监测设备以及每个处理过程中所用到的较少的设备。开发主要涉及建立直观概念和熟悉相关的指导原则。

所需设备是超滤-吸附系统应用的一个限制,以至现在还不能实现商业应用,但部分组间已用于商业化使用本文探讨的数据来源于整合了切向流动过滤装置的商业化数据,同时进行了适当修改使其包含整个线上处理中所需要UV、pH和传导器数据。几十年来这些被应用于各种规模的产品处理过程中,由于具备色谱介质,因此数据的可测量性不再是问题。而一个经验丰富的色谱工程师能在短短几小时内装配好一套功能完整的基本设备。

未来是否会有或者说企业何时才能引入新的仪器技术,这是很难预测的,但是一些关键的技术现已明朗:超滤技术完全可以满足企业创办者初期期望的处理效益。而且我们确定比起已知的传统技术,我们能更高效率的使用它。近年来化学行业和仪器的发展已把我们带入到一个空前的阶段去使用这些设备区做蛋白纯化工作。日益增长的生产力和经济需求正仰仗于工业的发展,同时我们期待的机遇需求可能正隐匿于此文中。

(本文来源:生物制品圈 )

(责任编辑:大林)

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