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2D-LC单中心切割的原理及在线除盐的应用

实验室资讯网时间:2019-01-17 点击: 百度搜索

【导读】直击操作 | 2D-LC单中心切割的原理及在线除盐的应用 第一章:单中心切割系统的组成 任何的2D-LC的组成一定会包括三个部分: 第一维液相系统 第二维液相系统 阀系统 其最核心的部分是阀系统,由阀系统将第一维液相系统,第二维液相系统连接起来。不同的2D-LC配置也会有千差万别,单中心切割是最简单......
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2D-LC单中心切割的原理及在线除盐的应用

直击操作 | 2D-LC单中心切割的原理及在线除盐的应用

2D-LC单中心切割的原理及在线除盐的应用
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第一章:单中心切割系统的组成

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任何的2D-LC的组成一定会包括三个部分:

  • 第一维液相系统

  • 第二维液相系统

  • 阀系统

其最核心的部分是阀系统,由阀系统将第一维液相系统,第二维液相系统连接起来。不同的2D-LC配置也会有千差万别,单中心切割是最简单的一种形式:阀系统是由一个流通阀组成的(八通阀,十通阀或者双二位四通阀也可以实现,本文主要描述六通阀),第一维液相和常规液相配置完全相同,而对于第二维液相系统最低配置的时候仅需要一个二元泵和一根色谱柱即可(建议第二维液相也配置紫外检测器,但是后面有的配图上不一定画第二维紫外检测器了,仅仅用质谱来代表第二维检测器)。如果需要,质谱则连在第二维液相的最后。

2D-LC单中心切割的原理及在线除盐的应用

上图是2D-LC单中心切割的典型配置。可以看出,第一维和第二维液相系统通过一个六通阀连在一起。对于第一维液相来说,六通阀可以选择性的切割某个组分(单中心切割);对于第二维液相来说,六通阀实际起到了一个进样器的作用。(后面还会详细的描述)

这时候不禁要问,仪器安装完毕后是堆在一起的,乍一眼看和普通的液质联用差别并不大,只是液相好像多了几个模块。上面图上的一维色谱柱,二维色谱柱,阀在哪里呢?如何区分一维泵和二维泵?如何区分一维检测器和二维检测器呢?

  • 阀和一维,二维色谱柱都在柱温箱里(也可以配单独外置阀驱动)

  • 第一维泵出口的液体毛细管和自动进样器相连接,而二维泵的出口液体毛细管是直接连在六通阀上面的。

  • 一维检测器的出口是连接在六通阀上面的;二维检测器的出口是连接在质谱上的。

  • 接下来我们来边看下面的动图边适当的脑补一下,然后是不是就能看明白了?

2D-LC单中心切割的原理及在线除盐的应用

第二章:单中心切割的概念

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2D-LC(二维液相色谱)可以分为两种主要的操作类型,即全二维和中心切割。(本文不涉及全二维的内容)其中中心切割二维液相色谱的目的在于测定复杂样品中具有代表性的一种或者几种目标化合物。取第一维色谱分离后的某个特定组分到第二维中进行再分析。

单中心切割是中心切割最简单的形式,也是2D-LC中最简单的形式,用简单的一句话来说就是:

第一维液相使用原始液相色谱流动相及方法(如缓冲盐流动相)对目标样品进行分离。当目标组分出峰时,通过切换将目标组分准确切割并捕获,第二维液相色谱泵将捕获的组分洗脱进行进一步的紫外和质谱检测。每次只切割第一维液相分离出的一种物质,就叫做单中心切割

如下视频演示了一次单中心切割的过程,可以看到第一维液相色谱分离出3个物质,其中物质1,3(橙色和紫色)从第一维液相直接进入了废液桶,只有第2个物质(红色)被切割进入了第二维液相继续分离,然后由第二维检测器(在这里用质谱来表示)采集数据产生第二维的图谱。

将特定物质切割进入第二维液相再次分离和检测会有很多的应用场景。比如可以使用不同的体系进行第二维分离得到更多的物质;也可以在切割的过程中使用捕集柱对某物质定量(如维生素测定);以及在液质联用的系统中进行在线除盐。

了解了单中心切割的作用后,接下来小编带大家学习单中心切割是如何实现的。

第三章:单中心切割的原理

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接下来我们会按第一维液相系统,第二维液相系统和阀这三个部分来详细的展示单中心切割是如何实现的。

第一维液相:

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第一维液相其实就是一套普通配置的液相色谱:包括泵,自动进样器,色谱柱(柱温箱)和紫外检测器。泵输送流动相进入进样器,进样后,物质经过色谱柱分离依次进入检测器产生第一维的色谱图,各个物质(峰)随着流动相流出第一维液相后依次进入六通阀。

第二维液相:

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第二维液相部分从二维泵开始,二维泵输送流动相进入六通阀,在这里六通阀其实起到了第二维液相进样器的作用,将从第一维液相带来的物质切割进入第二维系统中(具体原理在阀的部分会详细描述)。然后进入第二维色谱柱再次分离。经过第二维检测器(在这张图上使用质谱代替)进行检验。如果是在线除盐系统的话,为了避免盐进入质谱,还需要设置质谱的切换阀的位置,这个在后面会提到。

第二维液相始终和第二维检测器及质谱相连,六通阀起到了隔离第一维和第二维液相的作用。

 

六通阀(这是最重要的部分,精华都在这里了)

六通阀的使用范围非常广泛,不同的管线接法就可以在完全不同的场景获得不同的应用效果。可以用来切换色谱柱,可以用来进样(手动进样器和自动进样器中都使用六通阀),可以用来做在线富集反冲等等。但是其实六通阀内部的结构很简单:六个液体管路接口,两个状态(位置)。其中状态一是将1-6,4-5,2-3连通,状态二是将1-2,3-4,5-6连通。请参考下图。

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连接第一维和第二维液相的管路之后就变成了下图(实际连接方式不一定完全和此图相同),在这里我们用蓝色表示和第一维连通,绿色表示和第二维连通。

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状态一的时候(1-6),第一维液相检测器出口的液体的流入2号位,从3号位出进入loop环,loop环连到6号位并从1号位出进入废液。而第二维液相的泵连接5号位,液体直接从4号位流出进入二维色谱柱。此时loop环是在第一维液相流路中的。

状态二的时候(1-2),第一维液相检测器出口的液体的流入2号位,然后从1号位直接进入废液。而第二维液相的泵连接5号位,液体从6号位进入loop环,从4号位流出,进入二维色谱柱。此时loop环是在第二维液相流路中的。

搞清楚流路了以后,就来看看是如何做到单中心切割的,也就是把一维液相分离的某一个特定物质(峰)切换到二维液相中。

如下视频,特定组分(用红色的闪烁圆圈表示)从一维液相中分离出来,经过一维检测器检测后,进入六通阀中。此时阀在状态一的位置,所以物质会流过定量环。当物质经过定量环的时候,切阀到状态二,定量环突然变成二维流路的一部分,而在定量环中的待测物质就会被带入到二维色谱柱,然后进入检测器和质谱。

所以六通阀对于第二维液相系统来说,就是一个进样器。这下大家明白了吗?

要注意的是定量环的体积很小,一般是几十微升。如果按照第一维液相1ml/min的流速计算的话,40ul体积的定量环仅仅能保留0.04min的色谱峰宽。所以切割的时间是非常重要的,这一点需要注意。(使用捕集柱可以大大改善这一点)

如下图:第一维的物质能被切到第二维上的仅仅是峰上很小的一部分,然后再到第二维液相得到展开和分离。

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第四章:单中心切割在LC-MS联用中

实现在线除盐

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如今制药行业对杂质分析的要求是原来越高了,对于新药开发不能仅仅搞清楚主成份,还得搞清楚药品中包含了哪些杂质。上图就是一张有关物质的紫外色谱图,红色积分的杂质峰也必须要鉴定出来。

目前杂质鉴定需要使用液质联用来进行,但是质谱对于流动相的需求比较严格,不能使用磷酸盐等物质,且液相中常规使用1ml/min的流量对质谱来说也太大了。所以鉴定杂质,常规的做法是这样的:

  • 由于质谱不能使用含磷酸盐的流动性,于是必须先使用质谱兼容的流动相(甲酸,乙酸,甲酸铵,乙酸铵)重新摸索方法。

  • 由于质谱对于流量的要求一般是在0.2-0.6ml/min之间,因此1ml/min的常规液相流量会偏大,所以还得换内径更小的色谱柱,或者接三通分流。

  • 由于主成分含量很高,所以对质谱可能产生污染甚至对其他物质有抑制作用。

 

2D-LC的单中心切割可以帮助你轻松搞定上面的状况,使用单中心切割除盐有以下的好处:

  • 不需要重新摸索方法,原来液相方法不需要做任何改动即可使用,降低重新开发方法的繁复工作。

  • 第一维流路和第二维流路完全分开,因此不需要考虑原来方法中的流量或者流动相是否含有缓冲盐的问题。

  • 主成分可以完全不用进质谱,所以不用考虑主成分浓度问题。仅仅选择性切割需要分析的物质进入质谱。

  • 具体操作的时候,第一维液相的方法完全可以采用原来的方法,只需要把要鉴定的杂质(峰)从第一维液相中切割到第二维液相中,而第二维液相使用质谱兼容的流动相即可。大大的提高了杂质鉴定的效率。

第五章:质谱切换阀的协同除盐作用

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如果使用单中心切割做液质联用在线除盐的朋友这时候要提问了:定量环里面不是充满了第一维流动相中的盐吗?那这些盐怎么办?能让这些盐也不进入质谱吗?

办法当然有。

2D-LC单中心切割的原理及在线除盐的应用

如上图,在质谱设置界面里都有设置液相的流路是否进入质谱的选项,这个选项和时间表结合在一起使用的时候,就可以把没有保留而先流出的盐类物质切到废液,等待盐类物质切换至废液后,再把后面的物质切换到质谱中进行分析。

看下面的动图,只要在时间表里面设置正确的质谱切阀时间,就可以完美的把从第一维液相带来的盐切换到废液中,而不会污染质谱了。

2D-LC单中心切割的原理及在线除盐的应用

看到现在大家应该对2D-LC单中心切割及在除盐系统中的应用该都有大致的了结了吧。如果还有问题要问,可以留言提问。小编会慢慢的给与答复。

(本文来源: 安捷伦售后服务 安捷伦售后吴昊 )

(责任编辑: 龙景)

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