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高效液相色谱法测定饲料中磺胺喹恶啉方法研究

时间:2010-06-23 08:16来源:未知 作者:LabToday 点击:
高效液相色谱法测定饲料中磺胺喹恶啉方法研究 磺胺喹恶啉属磺胺类抗生素兼有抗球虫作用,广泛用于养禽业,其口服后吸收迅速,但排泄缓慢,残留在组织器官及鸡蛋中时间长,人食

高效液相色谱法测定饲料中磺胺喹恶啉方法研究

    磺胺喹恶啉属磺胺类抗生素兼有抗球虫作用,广泛用于养禽业,其口服后吸收迅速,但排泄缓慢,残留在组织器官及鸡蛋中时间长,人食用后,对人体产生耐药性等副作用。世界卫生组织(WHO)规定动物组织、奶的最高残留限量(MRL)值为100μg/kg。日本等国规定肉鸡中不得检出。因此,该药的使用应严格控制用药期及用药量,以保证产品的安全及对外贸易畅通。

    据英国兽药典记载,磺胺喹恶啉纯品为黄色粉末,几乎无味,不溶于水,溶于甲醇、乙醇,易溶于碱性溶液。目前,饲料中磺胺喹恶啉的检测方法美国AOAC标准是采用分光光度法,该法要求含阿散酸及不含阿散酸的饲料采用两种不同的测定方法。而国内饲料目前添加组分较复杂,检测者对饲料情况是未知的,难以确定用哪一个方法;且该方法中需要重氮化试剂做偶合反应,其毒性大,对操作者及环境 都会造成危害。因此,我们没有采用该法。另外,还有文献报道用气相色谱法测定,中间仍需重氮化衍生。我们最终选用高效液相色谱法。

    1.测定方法

    1.1原理 用甲醇水溶液提取饲料中的磺胺喹恶啉,离心,过滤,在HPLC仪上分离,紫外检测器240nm处测定。

    1.2 试剂和溶液

    以下所用的试剂,除特别注明外均为分析纯试剂;水为蒸馏水,色谱用水符合GB/T6682规定的一级水。

    1.2.1 磺胺喹恶啉标准品:含磺胺喹恶啉(C14H12N4O2S) 95.0%。

    1.2.2 甲醇:色谱纯。

    1.2.3 磷酸盐溶液:取磷酸二氢钾3.40g和磷酸氢二钾5.71g,加水溶解并稀释至1000mL。

    1.2.4 磺胺喹恶啉标准溶液:准确称取磺胺喹恶啉(4.1)50mg,溶于甲醇并稀释成0.1mg/mL的储备液,置4℃冰箱中避光保存,有效期1个月。临用前,取此储备液用水稀释成适当浓度的标准工作液。

    1.2.5 提取液:甲醇100mL+水50mL

    1.3 仪器

    1.3.1 实验室常用仪器设备

    1.3.2高效液相色谱仪(配紫外检测器)

    1.3.3 分析天平:感量为0.0001g和0.001g

    1.3.4 旋涡振荡器

    1.3.5 离心机:4000r/min

    1.3.6针头过滤器:备孔径为0.45μm 微孔滤膜

    1.4 分析步骤

    1.4.1 提取

    称取5g试样,精确至0.001g,加入提取液(4.5)50mL,旋涡振荡器混匀,超声水浴中提取15min,中间取出摇动1次,然后4000r/min离心5min,静置,取上清液过0.45μm滤膜,供液相色谱测定。

    1.4.2 标准曲线的制备

    准确吸取储备液适量,用水或流动相稀释成浓度分别为0.10、0.50、1.00、2.00、10.0μg/mL的磺胺喹恶啉标准溶液,做出标准曲线。

    1.4.3 测定

    1.4.3.1 色谱条件

    色谱柱:C18柱 柱长150mm,柱内径4.6mm,粒度5μm或性能相当者。

    流动相:磷酸盐溶液75mL+甲醇25mL,用前过0.45μm滤膜,并超声脱气。

    流速:1mL/min。

    检测波长:240nm。

    进样量:10~20μL。

    1.4.3.2 定性与定量

    根据标准品的保留时间定性,定量由标准曲线或单点校准。

    1.4.4 结果的计算

    每千克试样中含磺胺喹恶啉的质量按下式公式计算:

    m1

    x= — ×D

    m

    x——每千克试样中磺胺喹恶啉的质量(mg);

    m1——色谱峰面积对应的磺胺喹恶啉的质量(μg);

    D——稀释倍数;

    m——所称样品的质量(g)。

    平行测定结果用算术平均值表示,保留至小数点后1位。

    2.结果与讨论

    2. 1 色谱条件的确定

    大多数磺胺类药物常以磷酸/乙腈体系做为流动相,而磺胺喹恶啉在该体系下出峰时间是56min,影响检测效率。改用磷酸盐/甲醇体系做流动相。

    通过改变磷酸盐和甲醇的比例,磺胺喹恶啉的保留时间发生了变化。

    磷酸盐 : 甲醇 磺胺喹恶啉保留时间 (min)

    70 : 30 4.86

    75 : 25 7.80

    80 : 20 12.32

    出峰早磺胺喹恶啉与杂质峰相互干扰,出峰晚影响检测效率,峰形变宽。磷酸盐与甲醇比例75:25较为合适。

    2.2 方法线性与最小检出限

    对5.0、10.0、20.0、100.0 mg/kg的添加浓度按上述方法测定。

    添加浓度(mg/kg) 5.0 10.0 20.0 100.0

    峰面积 35906 71684 122536 771414

    线性方程为:y=7821.8~13601.6

    相关系数为:r=0.9992

    方法最小检出浓度为5.0mg/kg。磺胺喹恶啉的使用剂量鸡配合饲料是60g/t,能够检出低于用量10倍浓度已能满足检测需要。

    2.3 方法的准确度与精密度

    根据磺胺喹恶啉在配合饲料中允许使用量为60 mg/kg,取配合饲料分别制成5、60、100mg/kg的磺胺喹恶啉添加试样,每个浓度做5个平行,提取,上机测定,计算回收率及方法变异系数。

    添加量  实测值 回收率 变异系数

    (mg/kg) (mg/kg) (%)  (n=5)

    5      4.5    89.4   6.7

    60     55.6    92.6   2.1

    100     95.2    95.2   4.6

    2.4 适用范围

    取添加剂预混合饲料及浓缩料制成添加试样,提取,适当稀释上机测定。

    添加量   实测值 回收率 变异系数

    (mg/kg) (mg/kg)  (%)   (n=5)

    添加剂预混合饲料  200    190.2   95.1    5.4

    添加剂预混合饲料 1500   1480.6   98.7    2.1

    浓缩料            100     91.5   91.5    6.2

    总之,通过上述实验考查,说明该方法不仅适用于配合饲料,同样也适用于浓缩及添加剂预混合饲料。

    3. 结论

    通过上述实验考查,本方法提取操作简便、快捷,在此色谱条件下,分辨率高,干扰少,适用于配合饲料、浓缩料及添加剂预混合饲料中磺胺喹恶啉的测定。方法最小检出浓度满足实际监督检测需要,具有较好的准确度及精密度。

(责任编辑:LabToday)
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